药用蛋白冷冻干燥过程中变性及相应的保护措施

药用蛋白冷冻干燥过程中变性及相应的保护措施耿旭，李蚺，卞慧芳，吴自荣（华东师范大学生命科学学院分子生物学实验室，上海200062）征、原理；介绍了主要的保护措施即添加保护剂，并阐述了保护剂的作用机理：优先化作用、玻璃态假说和水代替假说。
随着生物技术的发展，许多药用蛋白被研究出来应用于临床，促进了药用蛋白的快速发展。但药用蛋白自身稳定性较差，已经成为制约药用蛋白发展和应用的限制性因素。而解决这一障碍的好方法是冷冻干燥。
冷冻干燥技术早于1813年由英国人华莱斯顿（Wollaston）发明。进入上个世纪的八九十年代后，冷冻干燥技术得到突飞猛进的发展。冷冻干燥技术具有许多优点，广泛用于食品、医药、生物等各个领域，例如冷冻干燥用于家兔眼角膜的保藏。现在已经上市的生物技术类药物大多数是采用冷冻干燥技术制备的。冷冻干燥技术的基本原理是把药品溶液在低温下冻结，真空条件下干燥，形成固体制剂。其中干燥过程又可分成2步：移走结晶水的初步干燥和移去结合水的二次干燥。
由于冷冻干燥实质上是物质和能量的传递过程，包括冷冻和干燥2个剧烈变化过程，因此冷冻干燥本身也会给蛋白质带来不良影响，导致蛋白质发生变性作用。通过对冷冻干燥过程中导致蛋白质变形作用因素的研究，人们发现影响因素复杂，各因素对蛋白质变性作用的大小、原理各不相同，而且各因素之间还存在一定相关性，并形成各因素导致蛋白质变性的机理。
冷冻过程和干燥过程都有变性作用，但它们的机理不相同。下面将分别讨论冷冻过程和干燥过程的变性机理。
1冷冻过程的变性机理冷冻过程的变性机理主要包括：低温变性和冷冻变性。其中冷冻变性主要是由于形成分枝状冰晶、增加离子强度、改变pH和发生相分离等因素造成的。
先开始定量研究低温对蛋白质模型的影响。他们研究发现牛肝脏过氧化氢酶在不同的低温条件下活性保留程度不相同。低温之所以能够引起变性是因为非极性基团在水中的溶解度随温度降低而增加，导致蛋白中的疏水作用减弱。像热变性一样，低温变性也是由焓驱动的。低温变性对寡聚蛋白影响比较大，因为寡聚体之间的相互作用被认为是疏水作用。理论上讲疏水作用力即解折叠自由能和温度之间呈抛物线关系。这意味着蛋白质不但有稳定对应温度，还有不稳定对应高温度和低温度。1.2冷冻变性机理冷冻变性主要包括4个方面的影响：浓缩影响、冰水界面的影响、pH值变化的影响和相分离的影响。对不同蛋白质来说，这些影响可能同时起作用或只有部分起作用。
1.2.1浓缩影响由于组成溶液的各种物质不是同步结冰的，往往是水先结冰，导致在冷冻过程中溶剂的浓度会逐渐提高。例如含0.：2004通讯作者：吴自荣（1947 -），男，教授，博士生导师，从事分子生物学、基因工程药物研究。E-mail：zrwubio.ecnu.edu.cn.在-21*C时，溶液浓度变为开始时的24倍。溶剂浓度的提高可能促进降解化学反应速率的提高，导致蛋白质变性。例如在部分凝固的溶液中氧浓度会增大，将导致蛋白中巯基的氧化速度加快。
1.2.2冰水界面的影响由于不同步结冰，冷冻过程中存在冰水混合物的阶段，形成冰水界面。蛋白质可能吸附在界面上，使结构疏松导致产生界面诱导的变性。快速冷冻形成的冰晶颗粒细小，冰水界面大。因此相对慢速冷冻，快速冷冻对蛋白结构影响更大。但也有学者认为冰晶大小对蛋白质变性有影响，持有不同意见。
1.2.3pH值变化的影响同样也是由于缓冲液中缓冲成分结晶不同步，导致冷冻过程中缓冲成分比例发生变化，引起pH值改变。例如常用的磷酸缓冲液中Na2HP04比NaH2P04容易结晶，因此两者的比例在冷冻过程会发生变化。磷酸钠盐缓冲液在pH=7时NaH2P04和Na2HP04的物质的量比是0.72，但在低温共熔点时两者的物质的量比变成57，这将导致冷冻过程中pH值下降。因为大多数蛋白只能在很小的pH值范围内稳定。当pH值改变后，溶液的离子强度将发生变化，使蛋白质中的极性基团之间的静电排斥力加大，导致蛋白质结构发生变化。pH值变化的影响可以通过使用磷酸钾盐缓冲液来减少，因为缓冲成分比在冷冻过程中变化小。
1.2.4相分离的影响由于冷冻过程中溶液的组成比例发生变化和各组分物理学特性改变，因此溶液可能发生相分离即液液相分离。其实冰水界面的影响也是相分离的结果，只不过它是固液相分离。研究表明液液相分离形成的界面也能使蛋白质变性。相分离的影响，根据国外研究可以采用改变溶液中的盐类、调整高分子之间的比例和化学修饰蛋白质等措施来改善。
2干燥过程的变性机理干燥过程的变性主要是发生在二次干燥阶段即移去结合水的阶段。蛋白质在水溶液中是水化的。水化的蛋白质表面有一层水分子包围，构成一个单分子层，这就是水化层。这层水分子是通过氢键和蛋白相互作用的。干燥过程要移去一部分水化层的水，移去水化层的水破坏r蛋白质表面的氢键结构，可能引起天然结构的变性。这是由于失去氢键的蛋白质可能把质子即氢转移给羧基，减少了蛋白质中的电荷布。电荷密度的降低有利于蛋白质之间的疏水相互作用增强，促进凝聚形成，导致变性。
3保护措施一保护剂在研究变性机理的同时，发现加入添加剂能够减少或阻止冷冻和干燥对蛋白质带来的变性，人们把这些添加剂称为保护剂。冷冻干燥保护剂主要是指化学添加剂、共溶剂、共溶质和赋性剂等。其中冷冻干燥配方中常用的是糖类和高分子化合物。
糖类中常用的是二糖，主要包括海藻糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和甘露糖等。而蔗糖和海藻糖又是常用的二糖。相对于蔗糖来说，海藻糖用作保护蛋白质效果更好，这是因为海藻糖的玻璃态转化温度高。此外，海藻糖还有一些优点：吸水性小；自身分子内部不形成氢键，有利于和蛋白质形成氢键；低的化学反应性。因此在许多药用蛋白的冷冻干燥配方中使用海藻糖。糖类的保护能力除了和种类有关，还和它的浓度相关。Pierre等人研究发现碳水化合物对人重组脱氧核糖核酸酶I和人重组胰岛素样生长激素I二级结构的保护能力和浓度有关。
高分子化合物中一个经常被用的是血清白蛋白。它既可以作为冷冻保护剂也可以用作干燥保护剂。它保护蛋白的效果得到研究的认可。但是由于它可能含有病原体，这阻碍了其应用。现在一般用重组人白蛋白代替血清白蛋白作为蛋白质的保护剂。此外，还有一些其他高分子被用作保护剂。例如：葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮（PVA）、羟乙基纤维素、明胶等。研究表明二糖和高分子相结合对药用蛋白保护效果更好。例如含有二糖和羟乙基淀粉混合物的重组人白介素-11冻干样品和仅含二糖或羟乙基淀粉的样品相比冷冻干燥后活性保留高。
4保护机理深人的研究了这些保护剂的作用原理，人们提出了?些理论其中被大家广泛接受和认可的理论主要有优先化作用、玻璃态假说和水代替假说。其中优先化作用主要是在冷冻过程中发挥保护作用；玻璃态假说和水代替假说主要是在干燥过程中发挥保护作用。
4.1优先化作用在溶液中保护蛋白质被普遍接受的机理是优先化作用理论。在保护剂存在下，优先化作用包括2方面：蛋白质优先和水发生作用即优先水化；保护剂优先从蛋白质表面排斥即优先排斥。这样蛋白质表面含有适当多的水和相对少的保护剂分子。保护剂优先从蛋白质表面进入溶液中，能在冷冻的过程中发挥保护蛋白质的作用。这个机理发挥保护作用的本质是提高了蛋白质的变性自由能。然而，有些现象优先作用机理不能解释例如高分子物质在冷冻过程的保护机理。由于优先化作用的发挥依靠水的存在，因此它不能在干燥阶段发挥作用。
4.2玻璃态假说所谓玻璃态是物质以非晶体形式存在的一种状态，粘度极大。玻璃态转化温度（TK）是指当溶液浓度达到大浓缩状态发生玻璃态转化时的温度。在干燥过程中，随着水分减少，溶液浓度增大形成玻璃态。这种高黏度的玻璃态具有保护蛋白质的作用是因为它阻碍了蛋白结构的变化。实际上玻璃态是一种不定形物质，比晶体物质更具有液态的特征，更有利于保持蛋白活性。有些保护剂就是由于形成晶体而降低保护能力，但通过其它试剂能改善这种不良影响。玻璃态粗略可以分成2种类型：脆的和坚硬的。两者相比，脆的玻璃态要比坚硬的玻璃态黏度大。因此脆的玻璃态具有更好的保护能力。此外对于玻璃态而言，许多保护剂例如高分子物质能够提高玻璃态转化温度（Tg），有利于在冷冻干燥以及后来的保存过程提高蛋白的稳定性。
4.3水代替假说在干燥过程中随着蛋白质水化层中水分失去，蛋白质表面的氢键遭到破坏，影响蛋白质的稳定。当保护剂代替水和蛋白质重新形成氢键，这样就满足了蛋白质表面带电基团形成氢键的要求，使蛋白质结构得到稳定。例如二糖能代替水和枯草杆菌蛋白酶形成氢键，阻止干燥诱导的变性。许多研究表明通过红外光谱能够观察到保护剂和冷冻干燥蛋白质确实存在氢键。不同的保护剂和蛋白质形成氢键有程度上的差别，这是由于它们自身结构差别造成的。可能是由于形成氢键能力的差别导致不同保护剂具有不同的保护能力。例如麦芽低聚糖的保护能力随着二糖单位数量增加而降低。这是由于和蛋白质相互作用的羟基数量减少造成的。
在干燥阶段，玻璃态假说和水代替假说究竟谁发挥保护作用还有争论。有认为在干燥阶段真正起到保护作用的机理是水代替假说，而不是玻璃态假说。例如S.Dean等人通过试验证明在冷冻干燥过程中玻璃态对兔肌动蛋白没有保护作用。
随着冷冻干燥技术的研究的深入和广泛应用，冷冻干燥机理已经逐步从定性转变为定量，建立了各种数学模型。例如Yoshioka等人通过公式计算来评估半乳糖苷酶冷冻干燥配方的保护作用。但实际上由于冷冻干燥技术是一门边缘学科，需要生物学、物理化学、药学、制冷、真空和控制等知识交叉和综合，因此还存在许多亟待解决的问题。例如变性和保护机理还不是完全清楚，各种数学模型还不完善，保护剂的研究还有待深人。
伴随“人类基因组计划”的顺利实行，后基因组时代蛋白质组的到来，基因工程药物的快速发展，冷冻干燥技术的研究将不断的深人，变性和保护机理将被深人理解，使冷冻干燥技术为重组蛋白质药物的开发作出贡献，促进人类的卫生事业向前发展战胜病魔。